总结报告一

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      我们实施了一项旨在检测多种物质对胰腺癌的抗肿瘤作用的研究。

      根据逻辑而言，我们以体外实验开始。鉴于UKRAIN这种物质显示出最明显的效果，因此我们实验的第二步既是在临床条件下检测体外实验所获得的阳性数据。因为这个原因，我们联系了受试物质的生产商，并要求他们向我们无偿提供足够用于治疗90位病人的受试物质，借此我们可以在实验方案中制定一个遵从于最佳临床实验管理规范（GCP）的准确的治疗计划。

      在实验方案通过了乌尔穆大学伦理委员会的统一表决并在相关政府委员会注册之后，在伦理学委员会的初步表决之后我们于1999年8月15日开始募集第一位病人。

      本实验将遵从最佳临床实验管理规范（GCP）和德国医疗法加以实施并进行评估。

 

      签名

 

      Priv. Doz. Dr. Frank Gansauge

      高资临床医生，肿瘤外科学

      第1基本外科

      乌尔穆大学

 

 

(省略)

 

 

 

 

 

 

      您投稿《Langenbeck’s外科文集》的稿件编号第01-542号“NSC－631570（UKRAIN^®）用于胰腺癌患者的姑息治疗III期临床试验结果”

 

      我们的审稿人目前已经完成了了您修改后的稿件的评阅。我们非常荣幸的告知您该稿件已被接受发表于《Langenbeck’s外科文集》。

 

      我们已经将您的稿件交予出版社，在数周内您将受到稿件校样。为了流畅的处理并及时的发表您的文章，我们希望您能在方便的时候尽快送回稿件校样。

 

      非常感谢您选择《Langenbeck’s外科文集》来发表您的文章。

 

 

      此致              

 

      敬礼

 

 

 

H G Berger 教授 医学博士

主编

《Langenbeck’s外科文集》

 

 

 

 

 

（1）：德国乌尔穆大学基本外科

（2）：德国乌尔穆bio，Venture Technologies

（3）；德国乌尔穆大学基本外科分子肿瘤研究组

 

收稿：2001年9月10日／接受：2001年11月27日／上线发表：2002年2月13日

摘要。背景：NSC-631570（UKRAIN）是由硫代磷酸和提自植物白屈菜的白屈菜生物碱的半合成化合物。它被用于辅助草药治疗各种良性和恶性肿瘤已有二十余年。患者／方法：在1999年8月和2001年6月间有90名经组织学检查证实而且已无法手术切除的胰腺癌患者参与了一项单中心随机对照研究中。A组的患者每周接受吉西他滨1000mg／m²治疗，B组的患者每周接受20mg的NSC-631570，而C组的患者每周在接受吉西他滨1000mg／m²后，再予20mg的NSC-631570治疗。研究的终点是总体生存率。结果：所有三组治疗均耐受良好，毒性反应中等。根据Kaplan-Meier分析，中位生存时间分别为A组5.2个月，B组7.9个月，C组10.4个月（A组与B组比较：p<0.01，A组与C组比较：p<0.01）。三组在6个月后的实际生存率分别为26%，65%和74%（A组与B组比较：p<0.05，A组与C组比较：p<0.01）。结论：我们的发现对于无法切除的晚期胰腺癌，NSC-631570单独使用和与吉西他滨联合使用几乎能够使患者的中位生存时间延长一倍。

 

关键词：胰腺癌，化学治疗，吉西他滨，NSC-631570，UKRAIN

 

    到目前为止，还没有发现对晚期胰腺癌患者非常有效的治疗手段。在过去的数年中，研究人员发现吉西他滨能够提高接受每周注射吉西他滨姑息治疗的胰腺癌患者的生活质量；然而，接受吉西他滨治疗的患者的中位生存时间仅能延长很少（1）。合用吉西他滨与5-FU的联合治疗（无论是否合用叶酸），或者吉西他滨与顺铂的联合治疗均都能延长中位生存时间至8.3个月（2-4）。与丝裂霉素C和吉西他滨联合应用的额外放疗不会明显的提高生存率（5）。在我们的诊所里，我们采用通过腹腔干经动脉注射5－FU、米托蒽醌和顺铂的治疗方法，可以获得生存时间延长的结果，但是这种局部化疗方案会导致住院时间延长（6）。

 

    数种来自植物的药物被用于肿瘤的治疗。白屈菜（Chelidonium Majus L）是罂粟科的一种植物，为欧洲与西亚的一种常见草本植物（7）。许多世纪以来，它被用于治疗疣，皮肤癌，肝脏和胆囊的疾病；在这种植物中发现的许多生物碱中最主要的成分是白屈菜生物碱（8）。NSC-631570（UKRAIN）是噻替哌和提自植物白屈菜的白屈菜生物碱的半合成化合物。研究人员认为NSC-631570由一分子硫代磷酸（噻替哌）与3分子的白屈菜碱结合而成。它作为替代治疗中的抗肿瘤药物已有20余年，但作用机制不明。然而，一些有良好前景的病例报道显示NSC-631570对肿瘤患者具有抗肿瘤作用（9-12）。

 

    本研究的目的旨在通过单中心随机对照研究评估这种由植物提取的药物（白屈菜碱）静脉给药对晚期无法切除胰腺癌患者的临床疗效。

 

 

 

    在1999年8月和2001年6月间我们一共征集了90名患者参与这项前瞻性的单中心随机对照研究。研究计划经当地的伦理委员会通过。吉西他滨由德国Giessen的礼来公司提供。奥地利维也纳的Nowicky制药公司慷慨的提供了NSC-631570。纳入标准为组织学证实且无法切除的胰腺腺癌。排除标准包括年龄在18岁以下，怀孕或没有避孕，其他的癌症性疾病，乙型肝炎、丙型肝炎或HIV病毒感染，免疫抑制治疗，或者中枢神经系统疾病。所有的患者在治疗之前均予知情同意。如果出现WHO规定的II级毒性，治疗剂量将减少20%，如果出现WHO的III级毒性，则暂时中止治疗待毒性反应恢复正常接着再继续给予减少了20%的剂量治疗。A组的30名患者按照近期由Burris［1］发表方案每周接受1000mg／m²的吉西他滨治疗（第一个疗程：治疗7周，休息一周，第2至12个疗程：治疗3周，休息一周）。B组的30名患者每周给予20mg的NSC-631570治疗（第一个疗程：治疗7周，休息一周，第2至12个疗程：治疗3周，休息一周）。而C组的30名患者每周在接受1000mg／m²的吉西他滨治疗之后，再予20mg的NSC-631570治疗（第一个疗程：治疗7周，休息一周，第2至12个疗程：治疗3周，休息一周）。在B组和C组中，在第一个疗程的第一个星期，头5天每天给与20mg／天剂量的NSC-631570。在所有三组中，大多数的患者补充了维生素，尤其是维生素C。在治疗的第一个星期患者接受住院治疗，之后的治疗则在门诊进行。在第3，6，9和12个月后，按照WHO的标准对患者进行再评估，包括胸部X光片，腹部B超检查和上腹部CT扫描。使用EORTC-QLQ-C30 3.0版对生活质量进行评估。在第一次评估前就死亡的患者被认为疾病恶化（PD）。每次治疗时都检查肿瘤标志物CA19-9。三个月时进行的首次再分级检查对肿瘤标志物反应做如下规定：完全有效（CR）：CA19-9正常超过4个星期，部分有效（PR）：CA19-9降低超过50%达4个星期，无变化（NC）：CA19-9降低在50%以内或升高不足50%，疾病恶化（PD）：CA19-9升高50%以上。每次均评估毒性反应和副反应。患者特征见表1。每组的30名患者均为随机分配。

 

*与A组相比有显著性差异（P<0.005）

 

 

 

 

    在接受吉西他滨单药治疗的实验组中30人中有25人死亡，2人中断治疗，3人目前仍在继续接受治疗。在完成治疗的患者中，平均疗程为3.8个（标准差：3.1，从1-12个疗程）。在接受NSC-631570单一治疗的实验组中，30位患者中有12人死亡，3人在完成了12个疗程后存活，2人中断治疗，13人仍在继续接受治疗。在完成治疗的患者中，平均用药疗程为5.6个（标准差：3.9，从1-12个疗程）。在吉西他滨和NSC-631570联合治疗的实验组中，30位患者中有19人死亡，2人中断治疗，2人在完成12个疗程后存活，7人仍在继续接受治疗。与吉西他滨单药治疗组相比，接受吉西他滨和NSC-631570联合治疗的实验组的疗程明显更多（3.8比6.8个疗程，P<0.005）。

 

 

    所有的三组治疗方案均耐受良好，没有出现严重的副反应。没有任何患者因为有害的副反应而需要终止治疗。A组中恶心似乎较另外两组更为常见（p<0.05），而B组和C组中发热更多见（p<0.05）。C组（吉西他滨加NSC-631570联合治疗）中WHOII级血液学毒性反应的发生频率明显的高于A组和B组（p<0.05）。在所有的三个实验组中，肝酶升高的频率相同，而且均与支架阻塞或肝脏转移所致的疾病恶化有关。4名患者出现了出血（B组2人，C组2人），对他们实施了血管造影介入治疗。副作用见表2。

 

 

 

    用EORTC-QLQ-C30问卷对生活质量进行了评定，分别在在治疗开始之前和以后每三个月评定一次。就问卷中的前28个问题而言，在治疗开始之前和之后三个月，三个实验组的患者之间都没有观察到明显的差异。而当对最后两个涉及自身对健康状况的评估（第29问）和自身对生活质量的评估（第30问）的问题进行分析时，我们注意到A组和C组的评分有明显的升高（图1 ）。

 

 

 

    在三组患者中，第一次再评估时肿瘤标志物的反应相似。根据CA19-9水平A、B和C三组中疾病进展仅出现在分别为27%、33%和15%的患者中。但需要加以注意的是，仅对那些CA19-9血清浓度升高和接受了再次检查的患者进行了评估，而那些CA19-9没有升高以及在第一次复查前就已经死亡的患者没有参加评估。

 

    根据WHO的标准，患者在治疗三个月后接受复查。A组和C组中分别有2名患者在第一次复查前就已经停止了治疗；B组中1名患者停止了治疗，还有9名接受治疗的患者未能到达治疗的第三个月。根据CT检查没有发现完全有效者。B组和C组中三个月后的部分有效和没有变化患者明显比A组更多（PR+NC：A：32%，B：75%，C：82%， A组与B组：p<0.01， A组与C组：p<0.001，卡方检验）（表3）。

 

表3. 进行姑息治疗的胰腺癌患者的反应和生存率

*p<0.05，与单独使用吉西他滨治疗相比（A组）

** p<0.01，与单独使用吉西他滨治疗相比（A组）

***p<0.001，与单独使用吉西他滨治疗相比（A组）

 

    至于实际生存率和中位生存时间，B组和C组中的患者与A组患者相比存活时间明显更长。6个月后的实际生存率为A组26%，B组65%，C组74%（A组与B组相比：p<0.05， A组与C组相比：p<0.01， B组与C组相比：没有明显差异）。9个月后C组的实际生存率仍明显高于A组（56%比13%，p<0.01）（表3）。这些升高的生存率还反映在根据Kaplan-Meier回归分析计算的中位生存时间上。B组和C组的中位生存时间（7.85个月和10.4个月）明显高于A组（5.15个月，分别为p<0.01和p<0.01）（表3，图2）。

 

 

 

 

 

 

图2  按照A、B和C三组方案进行姑息治疗的晚期胰腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线。（a）单独使用NSC-631570治疗的患者（A组，实线）的生存时间明显的比单独使用吉西他滨的患者更长（A组，虚线）。中位生存时间为A组：5.2个月，B组：7.9个月（p<0.01）。（b）接受NSC-631570和吉西他滨联合治疗的患者（C组，实线）的生存时间明显的比单独使用吉西他滨治疗的患者（A组，虚线）更长。C组的中位生存时间是10.4个月（p<0.01）。B组和C组的中位生存时间之间没有明显的差异。

 

 

 

 

鉴于NSC-631570被广泛的用于各种肿瘤的治疗，而且被认为是一种副作用很小的强有力抗肿瘤药物，故我们实施了这个在无法手术切除的晚期胰腺癌患者中进行了本次III期临床试验。在该随机对照研究中，患者接受了吉西他滨（最常用的胰腺癌治疗药物），或NSC-631570，或二者联合的治疗。单独使用吉西他滨治疗（A组）的结果与Burris与其同事发表的资料非常相似，能提高生活质量，并略微延长中位生存时间［1］，而单独使用NSC-631570治疗组（B组）中仅能观察到没有明显统计学差异的生活质量改善。两种药物的联合使用也能改善生活质量。至于副作用，三组均只有中等副作用。值得注意的是，在两个使用了NSC-631570的实验组中，均出现2例肿瘤出血至十二指肠，并不得不进行血管造影介入治疗。最近，有报道在使用白屈菜植物提取物治疗时发生急性肝炎［13］。在我们的研究中发现所有的三组患者都有胆囊炎伴随肝酶升高的情况出现，但后来发现原因均为肿瘤组织所致的支架或总胆管阻塞。有趣的是，两组使用了NSC-631570（B组和C组）的患者与单独使用吉西他滨治疗（A组）的患者相比，中位生存时间明显更长，这提示NSC-631570可能是治疗晚期无法手术的胰腺癌的有效药物。

 

总之，我们发现在无法手术的晚期胰腺癌患者中，吉西他滨与NSC-631570的联合治疗可使患者的中位生存时间延长几乎一倍。但是，由于治疗过程中出现了肿瘤出血这样的副作用，这种药物的使用必须在医疗监护下进行。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1：前两位作者对本文的贡献相同，为共同第一作者

2：德国乌尔穆大学基本外科系

3：德国乌尔穆大学分子肿瘤学部

 

 

UKRAIN，NSC-631570，胰腺癌，微管蛋白，有丝分裂抑制剂

 

 

 

在不知道其作用机制的情况下NSC-631570（UKRAIN^®）被用于辅助草药治疗各种良性和恶性肿瘤已有二十余年。最近，我们在一项在晚期不能进行手术治疗的胰腺癌患者中实施的II期临床试验中发现联合应用NSC-631570和吉西他滨几乎能够使患者的中位存活时间延长一倍。在本文中，我们将报道NSC-631570对胰腺癌细胞作用的分子模型。为了研究NSC-631570额胰腺癌细胞株AsPC1、BxPC3、MiaPaCa2和Panc1的作用，我们使用不同浓度的NSC-631570及其纯成分（噻替哌和白屈菜碱）进行了细胞周期分析、增生分析、Western blot分析，吉姆沙染色、使用抗α-微管蛋白抗体进行的免疫组化分析以及微管蛋白聚合作用分析。细胞周期分析显示浓度为0.6ug/ml或以上的白屈菜碱，浓度为5ug/ml或以上的NSC-6315705能够在所有受试细胞株中诱导出现显著的G2/M期细胞积聚现象（所有细胞株，48小时后：P<0.05）。在相同的浓度下，48小时之后均可以观察到明显的增生速度降低（所有细胞株：P<0.05）在吉姆沙染色试验中，我们发现明显的前期细胞聚集，而使用抗α-微管蛋白抗体进行的免疫组化分析则提示NSC-631570和白屈菜碱会导致受试细胞株的微管系统分解。而且，在体外聚合作用分析中我们还发现NSC-631570和白屈菜碱能够稳定单体微管蛋白。总之，通过实验我们能够清楚的发现NSC-631570和白屈菜碱能够通过稳定单体微管蛋白将胰腺癌细胞株的细胞周期进程抑制于M-期。

 

 

 

胰腺的癌症在所有消化道肿瘤中具有最差的预后之一（1）。一旦胰腺癌出现了临床表现，它就将以非常快的速度进展。通常在临床确诊之时就已经发生了转移，而且外科手术切除仅能在5%到22%的病人中实施（2-4）。为了不能切除的胰腺癌的治疗，已对姑息性全身治疗或局部化疗的有效性进行了广泛的讨论：研究人员发现每周注射吉西他滨治疗能够改善患者的生活质量但是却只能略微延长生存时间（5），吉西他滨和5-FU的联合应用（无论是否联合叶酸）或吉西他滨与顺铂的联合用药也能够改善病人的生存情况但是却伴有已知副作用（6-8），而丝裂霉素、吉西他滨与放疗的联合治疗却不能明显改善生存情况（9）。在我们的医院中，我们采用经腹腔干经动脉注射5-Fu、米托蒽醌和顺铂的联合治疗获得了生存情况的改善，但是该治疗却导致了长住院时间（10）。考虑到胰腺癌极低的可手术治疗率以及每年确诊晚期癌症的胰腺癌患者的数目，一种能够良好耐受的有效化学治疗选择将会获得巨大的成功。

 

数种来自植物的药物被用于肿瘤的治疗。白屈菜（Chelidonium Majus L）是罂粟科的一种植物，为欧洲与西亚的一种常见草本植物（11）。许多世纪以来，它被用于治疗疣，皮肤癌，肝脏和胆囊的疾病；在这种植物中发现的许多生物碱中最主要的成分是白屈菜生物碱（12）。NSC-631570（UKRAIN^®）是噻替哌和提自植物白屈菜的白屈菜生物碱的半合成化合物。研究人员认为NSC-631570由一分子硫代磷酸（噻替哌）与3分子的白屈菜碱结合而成。它作为替代治疗中的抗肿瘤药物已有20余年，但作用机制不明。然而，一些有良好前景的病例报道显示NSC-631570对肿瘤患者具有抗肿瘤作用（9-12）。

 

实施本文中所报道的NSC-631570及其纯成分，白屈菜碱和噻替哌对胰腺癌细胞株作用的体外研究的目的在于向我们最近报道的随机对照单中心临床II/III期实验提供理论基础（17）。

 

 

 

 

 

人类胰腺癌细胞株AsPC1、BxPC3、MiaPaCa2和Panc1取至美国菌种保存中心（ATCC，洛克韦尔，马塞诸塞，美国）。细胞在Dulbecco’s改良Eagle培养基（DMEM，Bio Whittaker公司，Verviers，比利时）中进行培养，并添加了10%胎牛血清（FCS），青霉素／链霉素以及谷氨酰胺（Biochrom，柏林，德国）。细胞在37℃下5%CO₂环境大气中培养，每3天传代一次。半铺满培养在不含胎牛血清的培养基中孵育24小时然后用添加了胎牛血清的培养基以及不同浓度的硫代磷酸NSC-631570由Nowicky制药公司（奥地利维也纳）。

 

 

细胞周期分析使用Cycle Test Plus系统（Becton Dickinson，德国）进行。采用Quest软件（Becton Dickinson）应用流式细胞仪对碘化丙啶染色的细胞核进行分析。

 

 

通过BrdU渗入及随后应用市面可购得的BrdU标记和检测试剂盒（Boehringer，Mannheim德国）的BrdU检测对增生进行测定。按照制造商的方案对细胞进行操作。

 

 

用2mM TRIS（pH 7.2），01mM EDTA和含蛋白酶抑制剂抑肽酶（1ug/ml）、白胃素（1ug/ml）、胃蛋白酶抑制素（1ug/ml）、N-己基顺丁烯二酰亚胺（1ug/ml）以及大豆胰蛋白酶抑制剂（10ug/ml）的1%Triton X-100溶解细胞。溶解液在SDS-PAGE加样缓冲液中煮沸5分钟。在3%成层胶的15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分辨出蛋白质（30ug），并使用转膜仪（Phase，Lubeck，德国）将其转移至硝化纤维膜（Schleicher和Schull，Dassel德国）上。用奶粉悬浊液（在PBS液中加入10%干奶粉）预孵育硝化纤维膜的方法阻断非特异性反应。在使用主要抗体孵育硝化纤维膜之后使用ECL系统（Amersham）检测结合情况。试验中使用了以下抗体：抗细胞周期蛋白A（克隆BF683，1:100），抗细胞周期蛋白B（克隆GNS1，1:100），抗细胞周期蛋白D1（克隆A-12，1:100），抗p-53（克隆DO-1，1:100），抗bcl-2（克隆100，1:100），抗p-27（克隆C-19，1:125）。所有抗体均购自Santa Crutz生物技术公司（圣·克鲁兹，加利福尼亚，美国）。应用β-肌动蛋白Western Blot分析确保等量加样。

 

 

有丝分裂分析在吉姆萨染色之后进行，染色方法为对用甲醇／乙酸（3:1）固定的细胞用10%吉姆萨染色剂（Sigma公司）染色。使用一种小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（Santa Crutz生物技术公司，克隆TU-02）进行微管蛋白的荧光免疫组化分析。简要的说，首先用冷PBS液漂洗有孔板（Chamber slides），然后在冰乙醇中固定细胞10分钟。在使用PBS液漂洗之后，细胞同α-微管蛋白抗体（1:50）一道在37℃下孵育1小时。在使用PBS液漂洗3次之后，用PE-结合的抗小鼠抗体（1:100，Dako，丹麦）覆盖细胞，然后孵育45分钟，最后在用PBS液漂洗并上镜观察。

 

 

使用一台温控Shimadzu UV 160A 分光光度计对体外微管蛋白聚合作用进行测量，用350nm处的浊度变化反映体外微管蛋白聚合作用。MES（（N-吗啉基）-乙烷磺酸）、EGTA（乙二醇双(α-氨基乙酸)醚四乙酸）、EDTA（乙二胺四乙酸）、MgCl₂、甘油、GTP（三磷酸鸟嘌呤核苷）和微管蛋白（来源于小牛大脑）均购自Sigma公司。简短的说，消化溶解的（lysophilized）微管蛋白在含有试剂的水中重构，用离心机（4℃下25.000g离心40分钟）分离单体微管蛋白。聚合作用缓冲液含0.1M MES、1mM EGTA，0.1mM EDTA、0.5mM MgCl₂以及2.5M 甘油。微管蛋白单体（1mg/ml）的聚合作用在37℃恒温条件下的1cm的光路小室（light path cells）中进行。通过添加1mMGTP启动GTP-依赖的结合反应，并且检测吸光度变化30分钟。然后添加20ug紫杉醇（Taxol^®）并继续观察吸光度变化20分钟以测定紫杉醇介导的聚合作用。

 

 

统计学意义水平的定义为P<0.01。所有的实验均至少重复3次。数据的分析采用非配对样品T-检验进行。

 

 

 

 

 

所有受试的与不同浓度白屈菜碱和NSC-631570一道孵育的胰腺癌细胞株均显示出在孵育24和48小时后出现剂量和时间相关性G2/M期细胞聚集现象。硫代磷酸能够在孵育24小时之后导致剂量相关性S-期细胞聚集，而且在48小时之后会导致G2/M期细胞增加（图1a显示了AsPC1细胞株在孵育24小时之后出现的典型的细胞周期分析结果）。在硫代磷酸和白屈菜碱混合物实验组中可以观察到与单独使用白屈菜碱处理的实验组相比S-期细胞仅有轻度增加而G2/M期细胞则显著增加。而且，接受白屈菜碱或NSC-631570处理的细胞中我们观察到亚-G1期细胞以剂量和时间依赖性方式增加。这些作用可以在所有细胞株中，白屈菜碱浓度0.6 mg/ml或以上的实验组中以及NSC-631570的浓度5 ug/ml或以上的实验组中被观察到（图1b显示了Capan1细胞株孵育24小时的剂量依赖性细胞周期分析结果）。我们实施了0.6 ug/ml的白屈菜碱和10 ug/ml的NSC-631570系列试验以研究G2/M停滞的动力学。在孵育开始4小时之后就能观察到G2/M期细胞出现明显增加。而且，在实验期间我们还观察到亚-G1期的细胞持续增加。因此实验还发现G1细胞明显减少（图1c显示了AsPC1细胞株的实验结果）。

 

 

为了检测白屈菜碱和NSC-631570的抗增生作用，我们实施了BrdU渗入分析。与白屈菜碱和NSC-631570一道孵育会以时间和剂量依赖的方式降低增生率（图2显示的是BxPC3细胞株与白屈菜碱一道孵育48小时后所获得的典型结果）。在接受浓度为0.6 ug/ml或更高的白屈菜碱处理24小时的所有细胞株中我们均观察到了明显的增生率下降。在使用5 ug/mlNSC-631570处理24小时的实验组中也可以观察到相似的结果。在处理48小时之后显著的增生抑制现象可以在接受浓度为0.2 ug/ml或更高的白屈菜碱和5 ug/ml或更高的NSC-631570处理的所有细胞株观察到。

 

 

应用以4小时为间隔的整体细胞溶解系列实验研究白屈菜碱和NSC-631570处理后的细胞周期相关性蛋白质的调节（图3a）。在处理细胞和对照细胞之间没有发现细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、p53、p27和bcl-2蛋白的水平出现有显著性差异的变化。而细胞周期蛋白B1则出现了非常显著的不同。接受了0.6 ug/ml白屈菜碱或10ug/ml NSC-631570处理的细胞出现了非常显著的细胞周期蛋白B1水平升高，这一现象在处理16、20和24小时后最明显（图3a）。

 

 

我们对接受白屈菜碱和NSC-631570处理的癌症细胞进行吉姆萨染色以研究处于有丝分裂期的细胞的比例。我们发现在使用白屈菜碱和NSC-631570处理之后的细胞中出现了剂量和时间依赖性前期细胞积聚现象（图3b显示AsPC1细胞株在暴露于2ug/ml白屈菜碱24小时后出现的典型表现）。在使用浓度为0.2ug/ml的白屈菜碱和1ug/ml的NSC-631570处理24小时的所有细胞株中均能观察到显著增加的停滞于前期的细胞。用60ng/ml的白屈菜碱和1ug/ml的NSC-631570处理48小时之后也可以观察到显著的停滞于前期的细胞积聚现象（图3c显示PanC1细胞株接受白屈菜碱处理48小时后的典型结果）。以4小时为间隔的系列试验显示浓度为0.6ug/ml的白屈菜碱和浓度为10ug/ml的NSC-631570在孵育8小时之后能够引起前期细胞显著增加。

 

 

使用抗α-微管蛋白抗体的荧光免疫组化分析对NSC-631570对癌症细胞的微管系统的影响进行了研究。我们发现在用0.6ug/ml的白屈菜碱或10ug/ml的NSC-631570处理的癌症细胞中几乎100%的细胞中都出现了胞浆微管系统破坏（图4a）。

 

 

我们实施了在含GTP和紫杉醇的条件下的单体微管蛋白聚合作用实验以研究白屈菜碱和NSC-631570在体外对微管聚合作用的影响。我们发现白屈菜碱和NSC-631570均能对由GTP-诱导的和紫杉醇介导的聚合作用产生明显的剂量依赖性抑制作用。在数个对紫杉醇介导的已聚合微管蛋白进行的实验中我们观察到添加白屈菜碱或NSC-631570（未显示其数据）后不会发生微管组合。与不同浓度的NSC-631570一道孵育（不添加GTP和紫杉醇）的单体微管蛋白在整个实验过程中均未显示吸光度变化。我们发现2uM的白屈菜碱和7uM的NSC-631570能够明显的抑制微管蛋白组合（图4b）。

 

 

 

      我们对白屈菜碱、噻替哌和NSC-631570对数种胰腺癌细胞株的细胞周期和增生的作用。在用白屈菜碱或NSC-631570处理之后，在细胞周期非分析中我们发现胰腺癌细胞中G2/M期细胞的比例显著增加，而且BrdU-渗入实验则显示增生率明显降低。有趣的是，噻替哌不会诱导G2/M期停滞现象而会导致S-期细胞积聚。鉴于这些作用在NSC-631570实验中未被观察到，因此未结合的噻替哌似乎在这种物质中仅起了很微小的作用。而且，等摩尔浓度的白屈菜碱能够比NSC-631570更有效的停滞受试细胞株，这与最近Panzer及其同事发表的数据相同（18）。完整细胞溶解产物的 Western Blot分析显示细胞周期蛋白B1显著增加而不伴有其他细胞周期相关蛋白质的变化，提示有丝分裂停滞。吉姆萨染色显示有丝分裂停滞的原因为细胞聚集于前期。众所周知许多M-期抑制剂会影响纺锤体的功能。我们进行了抗α-微管蛋白抗体免疫荧光组化分析以了解NSC-631570是否通过微管相互作用起效。实际上，我们在接受处理的细胞中发现了非常明显的微管网络破坏现象。体外单体微管蛋白聚合实验显示NSC-631570能够微管蛋白单体并且进而抑制微管组合，我们推测白屈菜碱也有同样的原理（19，20）。

 

      NSC-631570被用作一种替代药物用于多种类型肿瘤的治疗已经超过20多年了，但是其作用的分子模式一直不为人所知，而数个很有希望的病例报告显示NSC-631570对癌症患者具有抗肿瘤作用（13-16）。许多病人已经接受了NSC-631570治疗且没有严重不良反应的报道－因此在我们本次体外实验之后还余留下的一个问题就是NSC-631570是否对分裂更快的癌症细胞的作用比对非恶性形细胞的作用更强。基于先前的病例报告，并在获得了当地伦理学委员会的同意之后我们部门开展了一项对晚期、不能进行手术切除的胰腺癌进行治疗的随机对照单中心III期临床试验（17）。在该临床试验中我们用1000mg/sqm吉西他滨、20mg NSC-631570和1000mg/sqm吉西他滨与20mg NSC-631570 UKRAIN的联合疗法治疗了90位患者（每组30位病人）。有趣的是我们发现联合使用NSC-631570和吉西他滨几乎能够使患有晚期无法手术切除的胰腺癌的患者的中位生存时间延长一倍，而且我们并没有观察到与人们估计的一样联合应用两种强细胞增殖抑制剂所会导致的副作用增加的情况。在接受NSC-631570单药治疗的患者中可以观察到生存时间延长但是也可以观察到与使用一种细胞增殖抑制剂的化疗方案相似的副作用。这些临床观察提示NSC-631570既能作用于恶性细胞也会作用于非恶性细胞，但是其对癌症细胞的生长抑制作用与对正常细胞的作用相比占主要地位。

 

      总之，我们的实验清晰的显示NSC-631570和白屈菜碱是通过稳定单体微管蛋白起作用的强有丝分裂抑制剂。

 

 

图 说明：

 

图1：

于不同浓度的白屈菜碱和NSC-631570一起孵育的胰腺癌细胞的细胞周期分析。（A）AsPC1细胞株的典型细胞周期分析结果：与1.44ug/ml硫代磷酸、1.44ug/ml硫代磷酸和8.56ug/ml的白屈菜碱、8.56ug/ml白屈菜碱和10ug/ml NSC-631570一道孵育了24小时的3X10⁵个AsPC1胰腺癌细胞。其他细胞株可以获得相似的结果。（B）白屈菜碱或NSC-631570的细胞中出现的剂量依赖性G2/M-停滞和亚-G1期细胞增加现象。本例显示使用1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml和20ug/ml的NSC-631570处理24小时后的PanC1胰腺癌细胞株。其他细胞株的实验可以获得相似的结果。（C）0.6ug/ml白屈菜碱或10ug/ml NSC-631570孵育后的时间依赖性G2/M期和亚-G1期细胞积聚。本例显示：10ug/ml NSC-631570处理的AsPC1细胞株。*表示与对照相比P<0.05。

 

 

图2：

暴露于NSC-631570或白屈菜碱的胰腺癌细胞的生长抑制现象。在与浓度为0.2ug/ml或以上的白屈菜碱和浓度为5ug/ml或更高的NSC-631570一道孵育48小时之后在所有细胞株中均能观察到显著的生长抑制现象。本图显示：BxPC3细胞株与白屈菜碱一道孵育48小时。*表示与对照相比P<0.05。

 

 

图3：

与白屈菜碱或NSC-631570一道孵育之后胰腺癌细胞株的有丝分裂停滞。（A）在AsPC1细胞株中进行的以4小时为间隔的全细胞溶解产物Western Blot分析系列实验：与对照相比处理过的细胞株中可以检测到显著积累的细胞周期蛋白B1。（B）与2ug/ml的白屈菜碱一道孵育的胰腺癌细胞（AsPC1）的吉姆萨染色：可以观察到前期细胞明显积聚。（C）剂量依赖性前期细胞积聚。本图显示：接受白屈菜碱处理48小时的PanC1细胞株。*表示与对照相比P<0.05。

 

 

图4：

（A）使用抗α-微管蛋白抗体的碱解荧光免疫组化分析显示暴露于白屈菜碱或NSC-631570的胰腺癌细胞中出现了不正常的微管蛋白聚集。本图显示与10ug/ml的NSC-631570一道孵育了24小时的AsPC1胰腺癌细胞。（B）在存在GTP和紫杉醇的条件下与7、14和21uM NSC-631570一道预孵育之后的微管蛋白单体体外聚合作用实验。NSC-631570以剂量依赖方式抑制聚合作用。添加了1mM GTP和20ug紫杉醇。未填充的标记提示与对照相比p<0.05。

 

 

 

 

 

 

图例说明：

图1a：control：对照；thiophosphoric acid：硫代磷酸；thiophosphoric acid + chelidonine：硫代磷酸 + 白屈菜碱；chelidonine：白屈菜碱；

 

图1b：细胞周期分析：Capan1+/- NSC-631570孵育24小时

              percentage of cells：细胞的百分比

              control：对照；sub-G1：亚-G1期

 

图1c：细胞周期分析：ASPC1+10ug/ml NSC-631570

              percentage of cells：细胞的百分比

              time［h］：时间［小时］；sub-G1：亚-G1期

 

图2：增殖率：BxPC3+/-白屈菜碱-48小时

         % of control：对照的百分比

kontrolle：对照；chelidonine：白屈菜碱

 

图3a：全细胞溶解产物Western blot分析

time：时间；cyclin A：细胞周期蛋白A，cyclin B1：细胞周期蛋白B1，cyclin D1：细胞周期蛋白D1，cyclin E ：细胞周期蛋白E，β-actin：β-肌动蛋白；hours：小时

 

图3b：control：对照；2ug/ml chelidonine：白屈菜碱

 

图3c：前期细胞的百分比：Panc1+/-白屈菜碱-48小时

% of cells in prophase：前期细胞的百分比

control：对照；chelidonine：白屈菜碱

 

图4a：control：对照

 

图4b：体外微管蛋白聚合实验

OD 350nm：350nm OD值；control：对照；paclitaxel：紫杉醇；time［h］：时间［小时］

总结报告二： UKRAIN在结直肠癌III期随机对照临床试验

 

 

 

 

96位结直肠癌患者参与了该随机研究。48位接受了UKRAIN单药治疗（15位出现了转移而33位有未转移的结直肠癌）而48位接受了5-氟尿嘧啶（5-FU）和X-线治疗（同一个随机组）。治疗的结果（包括临床、血液学、免疫学和生化参数）显示因其肿瘤毒性作用和免疫调节活性UKRAIN在对结肠和直肠癌症进行单药治疗方面具有让人肯定的特性。接受UKRAIN治疗的转移结直肠癌组对象的反应率为40%。在5-FU治疗组中没有出现肿瘤消退现象。使用UKRAIN进行预治疗可以明显的改善病人的可手术性。接受UKRAIN治疗的患非转移结直肠癌的患者的存活率（高达21个月）为78.6%，而相应对照组的存活率则仅为33.3%。UKRAIN是治疗结直肠癌的一种新型有效药物。它既能有效地用于治疗转移性结直肠癌又能有效地对非转移性结直肠癌进行新辅助治疗。

 

 

UKRAIN的化学结构实际是一种白屈菜碱硫代磷酸衍生物：三｛2-｛[5bS- (5ba,6b,12ba) ]-5b,6,7,12b,13,14- 六氢- 13- 甲基[1,3] benzodioxolo [5,6-c-] -1,3 –dioxolo [4,5-i] phenanthridinium-6-ol]-ethaneaminy｝phosphine-sulfide 6HCl。

5-氟尿嘧啶的高毒性和让人不满意的效果提出了进一步研究发现可用于结直肠癌治疗的新药物（1,2）。体外、体内和临床的特殊免疫学活性（9-13）已经广泛的证明了UKRAIN的新特性（3-8）。已有研究使用不同的癌症细胞培养株对UKRAIN的肿瘤毒性特性进行了评估（EORTC，欧洲癌症研究和治疗组织，荷兰：E90/029，W122，UKRS-222；NSC B238865；国立癌症研究院，Bethesda，马里兰州，美国 NSC： 63 1570-W/1）（14，15）。试验显示UKRAIN能够提高吞噬细胞对小鼠的腺癌的肿瘤杀伤活性（16）。

 

美国国家癌症研究院，Bethesda，马里兰州，美国（17）已经发表的结果显示UKRAIN（NSC-631570）和传统的广泛应用的5-氟尿嘧啶（NSC-19883）相比对人类结肠癌细胞培养株（Colo 205， DLD-1，HCC-2998，HCT-116， HT29， KM12，KM20L2，SW620）具有超过100倍的细胞毒性活性。在EORTC研究中UKRAIN对结直肠细胞株CXF具有毒性。本次研究的目的是显示UKRAIN的体外作用和临床经验之间是否有相关性，并对UKRAIN作为治疗结直肠癌新药的作用进行评估。

表1：结肠癌的TNM和Dukes’分期

Patient group UKRAIN：UKRAIN组病人            Patient group 5-Fluoroufacil：5-氟尿嘧啶组病人

TNM-Staging：TNM-分期                             No of pts.：分数

Cancer of rectum：直肠癌                               Cancer of sigmoid：乙状结肠癌

Cancer of ascending colon：升结肠癌             Cancer of caecum：盲肠癌

 

       细胞生长抑制药物的毒性很免疫抑制作用对结肠癌患者的内环境稳定具有副作用。肿瘤治疗需要最大的对肿瘤细胞毒性和最小的对组织毒性并能改善免疫系统的功能。这正是UKRAIN诸多特性中的一种（18-21）。

 

    本次对照临床研究的目的在于比较分别接受UKRAIN或5-氟尿嘧啶治疗的四组患结直肠癌的病人的疗效并为这种严重疾病寻找新的治疗可能性。

 

 

       98位患有结直肠癌的病人（48位男性）参与了本次对照临床研究（表1）。他们的平均年龄为59.7岁。所有的肿瘤均经组织学证实为各种不同分化程度的腺癌（按照根据肿瘤淋巴结转移（TNM）分类的表1进行分期）。所有的病人均被告知制剂的治疗特性并被告知他们可在任何时候终止试验。在伦理学委员会批准了这次研究之后他们提供了他们的书面同意书。本次试验依照赫尔辛基宣言（1964），东京（1975）修订版、以及之后的威尼斯（1983）和香港（1989）修正案实施。采用计算机程序进行随机化。本次研究的方案被Bundesministerium für Gesundheit的Arzneimittelbeirat，Sport und Konsumentenschutz，奥地利以及基辅医科大学医院伦理学委员会接受。

      

有以下四个随机组：

1）  接受UKRAIN治疗的转移结直肠癌病人（15位病人）；

2）  接受UKRAIN治疗的未转移结直肠癌病人（33位病人）；

3）  接受5-氟尿嘧啶治疗的转移结直肠癌病人（15位病人）（第一对照组）；

4）  接受5-氟尿嘧啶治疗的未转移结直肠癌病人（33位病人）（第二对照组）。

 

在第一UKRAIN治疗组的15位患有转移结直肠癌的病人中有12位接受了姑息性手术治疗。在第二UKRAIN治疗组的33位病人中有25例接受了根治性手术治疗，3例接受了姑息性治疗，其它5例则在没有接受手术的情况下进行了治疗。UKRAIN治疗组每隔一天接受一次10mg UKRAIN静脉注射（每次2支5mg安瓿），共10次，总剂量：100mg。UKRAIN治疗的第一个疗程在手术前进行，接下来间隔10天，接着重复完全相同的疗程。在UKRAIN治疗之前或治疗期间均未进行化疗或X-线治疗。

 

第一对照组的15位转移及直肠癌病人中，有7例进行了姑息性手术；2位病人接受了X-线治疗。在第二对照组的33位病人中，在23例中实施了根治性手术，4例中实施了姑息性手术而6位病人在没有接受手术治疗的情况下进行了治疗。11位病人接受了X-线治疗。对照组接受了2个疗程的溶解于生理盐水（400ml）中的5-氟尿嘧啶600mg/m²隔日一次静脉注射治疗，总量5.5-6.0g。5-氟尿嘧啶治疗的第一个疗程在手术前进行而第二个疗程则在术后实施。对症治疗在两组中均相同。所有病人的Karnofsky指数介于50和90%之间。

 

通过比较治疗前后进行的检查的结果（包括：临床对照和不同的血液学、免疫学以及生化参数，内窥镜和超声波检查，以及对使用药物后的常见和特殊反应的评估）对疗效进行评估。

 

以下方法用于对参数进行评估：用IKO-31（CD-8）来确定抑制性T细胞（16），用IKO-86（CD-4）来确定辅助性T细胞（莫斯科肿瘤学中心）的方法来确定淋巴细胞亚群。杀伤细胞的活性由³H-尿嘧啶确定（22）。应用放射免疫扩散法来检测人类血清中的免疫球蛋白A，M和G。通过评估中性粒细胞对链球菌的吞噬活性来在显微镜下精细的确定吞噬活性。细胞吞噬指数指一个中性粒细胞所溶解的细菌数目。在使用UKRAIN和5-氟尿嘧啶治疗前后对病人均进行了肿瘤活检组织的病理形态学研究。存活率从随机化开始的时间指死亡或最后的通讯时间进行计算。

 

治疗的毒性指标由世界卫生组织规定（23）。

 

 

接受UKRAIN治疗的患有转移结直肠癌的1组病人，在第10到12天接受了5-6次注射之后所有的病例（100%）均出现了全身状况改善、毒性表现降低、疲劳减弱、呕吐减少、食欲恢复、亚发热状态（subfebrility）减少以及睡眠改善。10位病人（66.7%）在治疗后注意到了局部作用，例如：直肠出血减少，排便改善以及局部疼痛减弱。5位病人推迟了结肠造瘘术。在两个疗程的UKRAIN治疗后，Karnofsky指数从60.7增加至72.9。肿瘤淋巴结（Tumor nodes）变得软了而且活动性更佳。在15例病人中的6例中观察到了UKRAIN治疗后出现的原发肿瘤或转移性结直肠癌的肝转移灶尺寸的客观性减小（反应率40%）。在从1993年开始接受UKRAIN治疗的4例转移性结直肠癌患者中，3例病人的存活时间（duration-of-life）超过15个月而一位病人在两年后仍存活。

 

接受UKRAIN治疗的患结直肠癌的第2组病人中有30例（90.9%）出现了全身状况明显改善；13例（39.3%）患者出现了阳性局部作用（局部疼痛减轻；里急后重和直肠出血停止）。8位病人经过治疗之后获得了可切除性。在手术时没有发现转移。同时还发现肿瘤组织机械接触时出血减少且不伴有溃疡形成。在经过两个疗程的UKRAIN治疗之后Karnofsky指数从70.6上升至79.4。第二组中在1992年-1993年期间接受UKRAIN治疗的14位病人中，11位（78.6%）仍存活；他们中的2位没有接受手术治疗而9位接受了根治性手术。仅有1位接受了根治性手术的病人死亡。

 

在UKRAIN治疗的两组中，按照WHO标准计算毒性为0。未出现对针所予制剂的全身或局部阴性反应（包括过敏反应）的报告。3位病人在头3次注射时出现了体温升高超过38℃的现象，但是之后体温降至正常。

 

第1对照组中患有转移性结直肠癌的患者在接受5-氟尿嘧啶治疗后有14例病人（93.3%）出现了主观性全身状况恶化。我们观察到全身状况、食欲、睡眠的恶化以及出现疲劳。这些病人的毒性表现增加：恶心（毒性2），嗜睡（毒性2），心律失常（毒性1），以及手足综合征（根据WHO标准）。在5-氟尿嘧啶治疗数疗程之后Karnofsky指数从63.6下降至55.0。仅在1例（6.7%）病人中观察到了局部状况的改善（局部疼痛减弱以及直肠出血停止）。未发现原发肿瘤灶或转移灶出现客观性消退。3位在1993年接受5-氟尿嘧啶治疗的病人中没有1位生存超过11个月。在12例（80%）中我们观察到了5-氟尿嘧啶的肝毒性或肾毒性作用，而且在5例中由于肝毒性作用增加（表现为转氨酶活性出现2至3倍升高，以及胆红素水平升高超过正常值）而迫使化疗终止。尿中出现蛋白以及肌酐水平升高超过20%提示肾毒性。

 

第2对照组中患结直肠癌的病人有29例（87.9%）出现了全身状况恶化。仅在3例接受X-线治疗的病人中出现了局部作用（9.1%）。在5-氟尿嘧啶治疗后Karnofsky指数从70.3下降至65.6。在20例病人中我们观察到了肝、肾和神经毒性（60.6%）；有3例病人由于毒性作用仅接受了一个疗程的5-氟尿嘧啶治疗。在1992年至1993年期间接受5-氟尿嘧啶治疗的15例病人中，经过为期21个月的观察期后仅有5例仍存活（33.3%）；这5例中有3例接受了根治性手术治疗2例接受了姑息性手术治疗。在死亡的10例病人中，有5例接受了根治性手术。

 

血液学、生化和免疫学参数的平均值列于表2。我们注意到UKRAIN治疗组的以下参数出现了阳性（良性）变化：

1．淋巴细胞，B-淋巴细胞增加

2．红细胞沉降率（ESR）下降

3．T-淋巴细胞增加的趋势（图2）；Y-辅助细胞增加（图3）；

4．杀伤细胞活性增加（图4）

5．细胞吞噬活性和细胞吞噬指数增加

6．H/S比恢复正常

7．IgG增加

8．循环免疫复合物减少

9．大颗粒淋巴细胞增加（图5）

10． 外周血淋巴细胞增加（图6）

11．生化状态未出现负性改变（恶化）。

 

表2：血液学、生化和免疫学参数的平均值

图例说明：

T lymph：T-淋巴细胞 B-lymph：B-淋巴细胞

before U：使用UKRAIN之前 after U：使用UKRAIN之后 before 5FU：使用5-氟尿嘧啶前

after 5FU：使用5-氟尿嘧啶之后

图2：T-和B-淋巴细胞的测定

图3：T-辅助细胞和T-抑制细胞的测定

 

 

       肿瘤区域的活检组织学检查显示腺癌包块相对减小，但是肿瘤坏死增加。可发现侵入的淋巴细胞。有些病例出现腺癌基质发生硬化。在一例直肠癌患者中我们发现基质中出现了成熟胶原形成。坏死出现在血管周围区域。未发现在活检间期出现肿瘤组织增生或转移灶形成。